DNA的限制性酶切及電泳分析實驗方法？

1. 反應體系的建立：⑴ 在一無菌1.5 ml Eppendorf管中加入：?無菌雙蒸水 7 μl?10×酶切緩沖液 2 μl?質粒DNA(100 ng/μl) 10 μl?EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl?總體積為20μl⑵ 輕輕混勻，12000 rpm離心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。3. 將Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通過加熱使酶失活以終止反應。4. 12000 rpm離心5 sec，將管蓋及管壁上的水離下。5. 取10 μl消化產物，與2 μl 6×上樣緩沖液混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測消化效果，電泳條件：約100 V 30～60 min。6 結果觀察。操作注意事項：1. 吸樣量一定要準確2. 為了不使酶污染而導致浪費，最后才加酶3. 要求在冰上操作，并充分混勻，4. 開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防污染。5. 樣品在37 ℃與65 ℃保溫時，將離心管蓋嚴，以防水進入管內造成實驗失敗。限制性內切酶酶解中常見的問題和原因1. DNA完全沒有被限制性內切酶切割：①限制性內切酶失活;②DNA不純，含有SDS、有機溶劑、EDTA等;③非限制性內切酶最佳反應條件;④酶切位點被修飾;⑤DNA上不存在該酶的識別順序。2. DNA切割不完全：①限制性內切酶活性下降或稀釋不正確;②DNA不純或反應條件不佳;③酶切位點被修飾;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。3. DNA片段數目多于理論值：①限制性內切酶星號活力;②存在第二種限制性內切酶污染;③樣品DNA中含有其它DNA。可以到生物幫上查找這方面的信息啊，那里擁有生物領域內豐富的資源，有空的話，可以去 www.bio1000.com/zt/dna/164670.html 那里看下啊。